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如何讓樣品保持在生理狀態
為什么持續控制氧氣特別重要?
氧氣是大多數生命形態存在的基本要素。對于生命科學研究人員而言，氧氣是一種電子受體，一種生命所必需的高活性分子，以及一種影響生物中每一個單一活動和反應的分子。一般情況下，大氣含氧量被認為是21%。
然而，當吸入空氣時，組織氧合下降到約5%。從肝至肺上皮中，氧氣水平約為14%，腸粘膜腔實際上是無氧的。在這些百分比中，不同的組織中有不同的氧氣水平，但最重要的是，沒有一個組織的細胞會暴露在21%的氧氣水平中。事實上，21%的氧氣會形成活性氧自由基(ROS)及其中間體，因此對細胞具有高毒性。當產生的ROS超過細胞的抗氧化能力時，ROS就開始破壞大分子，如蛋白質、脂類和DNA。
缺氧是細胞和組織通過血流增加、血管舒張或上調氧應答基因對一定的氧氣水平作出響應，以期維持它們的氧氣水平。這些響應會在氧氣水平低于某一特定點后發生，這個點在各組織和細胞間各不相同。正常組織在3%到10%的氧氣水平之間得以維持，低于該水平被視為低氧狀態（最恰當的描述是缺氧）。
由于是在非生理條件下進行研究,因此,在很多，甚至可能是大部分的研究中都要隱藏生理表型。由此，了解各項研究中器官或組織的氧氣水平，以獲得可轉移的和生物學相關的實驗結果是很重要的。每個組織和器官都有各自的氧合狀態，反映了各自的功能。當氧氣含量過高或過低時，其影響涉及單基因表達到蛋白質組水平。
Baker Ruskinn公司的OxyGenie
OxyGenie是一個小型便攜式孵育平臺，可將您的樣品保持在缺氧狀態或您想要的空氣中。OxyGenie可以由電源以及電池驅動，不管是在實驗室，還是外面 , 您都可以控制樣品狀態。它由1至6個獨立的1孔培養室組成，每個培養室有自己的進氣口。OxyGenie配有兩個循環充氣瓶(Catalina Cylinders，美國加利福尼亞州)，可以充您想要的氣體成分比例。通過調整氣瓶的出口壓力來調節氣體流量。兩個裝滿的氣瓶可供6個樣品室使用16小時。溫度由ITO加熱器和控制器（Okolab s.r.l.，意大利）控制。每個樣品室下方都有一個6孔分流器，通過該分流器，細胞可以在不中斷生理參數的情況下，例如在光學顯微鏡成像時與基底分離。
圖1. A：Baker Ruskinn OxyGenie移動式孵化器。B：組裝硅細胞培養孔
樣品室經過優化，以實現高分辨率成像。樣品室的底座為高質量的玻璃蓋。每個樣品都是一個迷你孵化器，配有不同的蓋子和鎖。經過優化的樣品室可容納1mL的樣品培養基，并以光學透明玻璃蓋密封。蓋鎖是為了預防潛在的蒸發。外蓋鎖將蓋子牢固密封。最后一層外蓋與系統的氣體軟管連接。
為Coral Life改編
為了在整個活細胞CLEM工作流中維持合適的生理條件，我們利用了OxyGenie可以在冷凍固定之前確保細胞生理狀態的能力。然而，為了適應工作流的需要，我們做了一些定制化的改變:
在EM ICE上進行高壓凍結時，使用6 mm的藍寶石盤作為樣品培養皿。此外，為了實現最佳的實時成像，能否在藍寶石盤上實現水浸式成像至關重要。因此，我們將腔室底部的玻璃蓋換成一個在中心有6.5 mm孔的35 × 35 × 1 mm玻璃載玻片（稱為SampLink樣品杯)。該孔與EM ICE中間板對齊，直達藍寶石盤的中心。使用蠟封將中間板和藍寶石基底連接到SampLink基杯的底部。中間板與SampLink基杯的對齊和連接見Coral Life操作手冊的5.2節的描述。
成像后，EM ICE中間板必須快速脫離SampLink。因此，EM ICE加樣區配備了滑動和分離機制，可將中間板從玻璃基底分離，并將其直接放置在正確的位置進行冷凍。
圖2：為Coral Life準備的EM ICE加載區。
SampLink室的細胞活性和細胞毒性
為確保樣品在改良后的SampLink室中保持活性，需要開展細胞活性和細胞毒性測試。實驗使用哺乳動物的成纖維細胞系L-929 (ATCC編號CCL-1，批號13)，由奧地利維也納的OFI技術與創新公司執行。細胞(105細胞/ ml)接種在藍寶石盤上(50 μl)或整個樣品室底部(500 μl)。作為對照，將相同的稀釋細胞接種在96孔板(50 μl)或12孔板(500 μl)中。樣品和對照品在37°C和5%二氧化碳水平下孵育24小時。測試細胞毒性，以評估牙蠟對種子細胞質量的影響(圖3)。根據ISO 10993--5:2009標準測定細胞毒性。
圖3：可見與EM ICE中板接觸的、在藍寶石盤側的牙蠟(紅色圈)。
為進行光學評估，用MTT對樣品進行了染色
活細胞可將MTT轉化生成甲臜，顏色由黃色變為紫色/藍色，可通過光度計的吸收測量來檢測。去除培養基，用50 μl或500 μl MTT溶液（DMEM中1 mg/ml）對細胞進行染色，在37℃，5%二氧化碳水平中孵育2小時。然后用50 μl或500 μl異丙醇替代染色劑。將溶液轉移到96孔板上，在波長范圍560 ~ 650 nm內測量吸收。細胞形態學的光學評估顯示，試驗樣品和對照樣品均為正常的成纖維細胞，如圖4所示。
圖4：用MTT染色的陰性對照樣品
所有測試樣品的細胞活性為85±7%
結合形態學的評估，Coral Life工作流清楚地顯示，SampLink室作為非常合適的實驗工具，可以在任何活細胞實驗中，將您感興趣的細胞保持在特定的生理狀態。
